改善された分析物特異性を有するバイオセンサー

专利摘要:
生体試料中における分析物濃度の決定における使用のための化学マトリックスは、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、アルキルフェナジン四級塩、及びニトロソアニリンを含む。当該化学マトリックスは、電気化学的バイオセンサーと共に使用され、反応がバイオセンサー内で起こった後に分析物濃度を決定し、この時点で分析は、濃度を決定するために完了されている。グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、アルキルフェナジン四級塩、及びニトロソアニリンの化学マトリックスを使用して分析物の濃度を決定する方法が、記載された別の態様である。当該方法はまた、５秒以下の試験時間でさらに特徴付けられる。当該新規化学マトリックスを利用する方法は、約２０〜６００ｍｇ／ｄＬの濃度、ｐＨ約６．５〜約８．５において、分析物、例えば血液グルコースを容易に決定し得る。
公开号:JP2011515686A
申请号:JP2011501136
申请日:2009-03-25
公开日:2011-05-19
发明作者:ディー． ウィルシー，クリストファー；ゴシャル，ミタリ；ビーダー，ヘルベルト
申请人:エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ；
IPC主号:G01N27-416

专利说明:

[0001] 本開示は、生体液中の分析物の存在及び／又は濃度を測定するための化学マトリックス及び方法に一般的に関する。より具体的には、排他的ではないが、本開示は、妨害物質の存在下において、電気化学的バイオセンサーを用いて分析物を測定するときに、分析物特異性を増加させる化学マトリックス及び方法に関する。本明細書において、用語「化学マトリックス」とは、分析物と反応することができる少なくとも一つの化学物質を含む、物理的領域のことである。]
背景技術

[0002] 特に、他の紛らわしい物質の存在下、及び多様な条件下において物質の濃度を測定することは、多くの分野で重要である。例えば、多様な条件下、及び妨害物質の存在下における、体液、例えば血液中のグルコースの測定は、糖尿病の有効な治療にとって重要である。血液グルコースレベルの適切な調節の失敗は、失明、及び糖尿病患者の指、手、足などの使用を最終的に奪い得る、四肢における循環の欠乏を含む、ひどい合併症を引き起こし得る。]
[0003] テストストリップ（ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ）は、試験試料中の選択された分析物の存在及び／又は濃度を測定するために通常使用される。例えば、種々のテストストリップが、糖尿病患者の血糖レベルを測定するために、血液中のグルコース濃度を測定するために使用される。これらのテストストリップは、試薬組成物が沈殿した反応容器を含む。テストストリップの現在の傾向は、より小さい試験試料、及びより早い試験分析時間を必要とする。前腕のような、身体において敏感ではない領域から得ることができる、より少量の試験試料を使用したとき、著しい利益が患者へ提供される。さらに、より早く且つより正確な試験時間は、さらなる利便性、及び患者の血糖レベルのより優れた調節を提供する。]
[0004] 分析物、例えば血液試料中のグルコースの濃度を測定するために、幾つかの方法が知られている。かかる方法は通常、２つの分類：光学的方法、及び電気化学的方法の一つに該当する。光学的方法は通常、試薬中のスペクトルのシフトを観測する、反射分光法又は吸光分光法に関連する。かかるシフトは、分析物濃度を示す色変化を生み出す化学反応によって引き起こされる。電気化学的方法は通常、分析物濃度を示す、電流測定、電量測定、電位差測定、及び／又は導電性応答に関連する。例えば、米国特許第４，２３３，０２９号明細書（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ）；米国特許第４，２２５，４１０号明細書（Ｐａｃｅ）；米国特許第４，３２３，５３６号明細書（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ）；米国特許第４，００８，４４８号明細書（Ｍｕｇｇｌｉ）；米国特許第４，６５４，１９７号明細書（Ｌｉｌｊａ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第５，１０８，５６４号明細書（Ｓｚｕｍｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第５，１２０，４２０号明細書（Ｎａｎｋａｉ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第５，１２８，０１５号明細書（Ｓｚｕｍｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第５，２４３，５１６号明細書（Ｗｈｉｔｅ）；米国特許第５，４３７，９９９号明細書（Ｄｉｅｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第５，２８８，６３６号明細書（Ｐｏｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第５，６２８，８９０号明細書（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第５，６８２，８８４号明細書（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第５，７２７，５４８号明細書（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第５，９９７，８１７号明細書（Ｃｒｉｓｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第６，００４，４４１号明細書（Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第４，９１９，７７０号明細書（Ｐｒｉｅｄｅｌ ｅｔ ａｌ．）；及び米国特許第６，０５４，０３９号明細書（Ｓｈｉｅｈ）を参照（これらは全体において、参照により本明細書に組み込まれる）。電気化学的方法は通常（常にではないが）、試薬存在下における血液試料の電気化学的応答を測定するために血液グルコース計測器を使用する。当該試薬は、グルコースと反応して、血液中に存在しない電荷担体を産生する。結果的に、得られたシグナルの存在下における血液の電気化学的応答は、血液グルコース濃度に主に依存することが意図されている。電気化学的グルコース計測器において使用される典型的な試薬は、米国特許第５，９９７，８１７号、第５，１２２，２４４号、及び第５，２８６，３６２号明細書に開示されており、そしてそれは全体において参照により本明細書に組み込まれる。]
[0005] 多くの誤差原因は、体液中の分析物レベルを測定するときに不正確な結果を生じ得る。計測器が曝露される厳しい条件は時折、計測器の正確性を悪化させる。場合により、当該計測器は、通常「ストリップ腐食（ｓｔｒｉｐ ｒｏｔｔｉｎｇ）」又は「バイアル誤用（ｖｉａｌ ａｂｕｓｅ）」と呼ばれる有害な条件に曝され得、そしてそれは保存時に当該計測器が誤用され、並びに有害な条件、例えば過度の熱、光、及び／又は湿気に曝されるときのことである。過度の熱、及び／又は湿気へのこの曝露により、酵素活性の失活による反応時間の遅延が生じる。]
[0006] 従来、これらの問題は、測定される分析物との、非常に早い反応時間、及び非常に特異的な活性を有する酵素を使用することによって回避されてきた。これらの特定の特性を有する酵素を利用することによって、全ての試験条件下、例えば種々の温度及びヘマトクリットレベルにおいて、高い及び同レベルの完結を有する反応が達成され得る。しかし、実際の問題として、酵素は通常、当該計測器の性能における著しい喪失を引き起こすことなく、十分に多い量で計測器中に組み込まれることができない。さらに、高い特異的活性を有する酵素は、全ての分析物に対して必ずしも所望ではない。例えば、グルコースレベルを決定するためのかかるシステムは、不正確な読み込みを引き起こし得る妨害物質、例えばマルトース、ガラクトース、キシロースなどの効果が回避される必要性について対処することができない。]
[0007] 例えば、腹膜透析又はＩＧＧ治療を受ける患者は、血液中に高レベルのマルトースを有し得、そしてそれは正確な血液グルコースの読み込みを阻害し得る。したがって、マルトースからの妨害は重要な問題である。実例として、Ａｂｂｏｔｔ−１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＦｒｅｅｙｓｔｙｌｅ（登録商標）血液グルコースモニタリングシステムは、様々な試験時間で、電量測定技術と合わせて、グルコース−染色−酸化還元酵素（ＧｌｕｃＤＯＲ）を使用する。しかし、かかるシステムは、マルトースからの妨害のために臨床的に未だ承認されておらず、及び実用的な問題として、現在使用されている電量測定の使用は多くの大きな欠点がある。さらに、グルコースに対してより大きな特異性を有する新規ＧｌｕｃＤＯＲ酵素をクローニングすることによって、マルトース妨害効果を最小化する試みがなされている。しかし、実現可能な解決法をもたらす進展はなされていない。]
[0008] さらに別の例において、Ａｂｂｏｔｔ−１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰＣｘ／ＴｒｕｅＭｅａｓｕｒｅ（商標）システムは、実質的にマルトース妨害を回避したシステムを提供する、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）−依存性グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ／ＮＡＤ）を用いた電流測定を利用する。しかし、電流測定システムは、試料が採取される場所を含む種々の要因による、グルコースレベルの読み込みを変化させる効果を有する、血液酸素レベル（ｐＯ２）の妨害のために、不正確な読み込みを提供し得る。例えば血液酸素レベルは、当該試料が毛細血管血、静脈血、又は動脈血であるか否かに依存して実質的に変化し得る。したがって、酸素妨害を最小化するために、これらのシステムのユーザーは、サンプリング前に血液試料の源又は性質を示さなければならない。好適には、当該ユーザーに対する、血液試料に関する情報開示の要求は、当該情報が当該ユーザーによって誤って開示された場合に、さらなるエラー源を提供する。]
[0009] 酵素活性を遅延させることに加えて、バイアルの誤用はまた、読み込み時において、時折「ブランク電流」と呼ばれる、バックグラウンド電流の増加をもたらし得る。種々のバックグランド又はブランク電流源が存在する。例えば、酵素から電極へ電子を移動させるために使用されるメディエーターが、当該センサーが使用される前に酸化状態で存在することが望ましい。時間とともに、バイアル誤用による熱及び／又は湿気は、当該メディエーターを減少させる傾向にある。当該メディエーターの一部が、当該センサーが使用される前に還元状態で存在する場合、当該電流の一部が、当該メディエーターの還元状態を酸化させる作用電極から生じるだろう。生じるバックグラウンド又はブランク電流は、当該メディエーターにバイアスをかける傾向にあり、そしてそれは次に、不正確な結果をもたらし得る。当該試薬中の他の不純物はまた、バックグラウンド又はブランク電流の問題を増大させ得る。]
[0010] ブランク電流問題に対処するために、「バーン−オフ（ｂｕｒｎ−ｏｆｆ）」手法を使用する電流測定センサーが提案されている。この手法において、２つのＤＣシグナルが当該センサーに適用される。第一のＤＣシグナル、又はバーン−オフシグナルは、当該分析物を分析するために後に使用される同一の拡散層中において、ブランク電流に関与する任意の種を消費又は酸化するために使用される。その後、第二のシグナル又は分析シグナルが、分析物レベルを分析するために使用される。バーン−オフ電位及び分析電位の両方は、同一の極性を有する。このバーン−オフ技術は、ブランク又はバックグラウンド電流の効果を減少させるが、測定されるべき分析物を部分的に酸化（又は還元）すること犠牲にしてそのようになされ、それによりセンサーのノイズ−シグナル比を減少させる。さらにかかる技術は、少数の例で示される、温度、及び遅い／可変の反応速度を有する酵素のような要因によって生じる、反応時間における変動を埋め合わせることができない。さらに、かかるセンサーにおいて使用される酵素は、マルトース妨害の影響を受けやすい傾向にある。]
[0011] 上記の観点から、分析物（例えばグルコース）を測定するために利用されるバイオセンサーは、当該分析物に対する増大した特異性を持つ化学マトリックスを有することが所望であり、そして酸化レベルにおける変動から、及び関連する物質（例えばマルトース）からもたらされる妨害を最小化可能であることが所望である。光化学的に安定である化学マトリックスを提供することがさらに所望である。]
[0012] 本明細書において開示された組成物、方法及び装置の実施形態は、分析物（例えばグルコース）に対する増加した特異性を有し、酸化レベルにおける変動から、及び関連する物質（例えばマルトース）からもたらされる妨害を最小化することができる化学マトリックスに関する。広範において、当該化学マトリックスは、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フェナジン誘導体、及びニトロソアニリンを含む。当該化学マトリックスの好ましい実施形態は通常、ｐＨ約６．５〜約８．５で安定であり、そして光化学的に安定である。化学マトリックス、又はその構成要素が少なくとも１時間通常の蛍光に対する曝露において無色であり続ける場合に、当該化学マトリックス、又はその構成要素は、光化学的に安定であると考えられる。]
[0013] 本開示の第一の態様は、分析物濃度の分析における使用のための化学マトリックス組成物を提供する。ｐＨ約６．５〜約８．５で安定であるこの化学マトリックスは、光化学的に安定であり、そしてグルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、アルキルフェナジン四級塩、及びニトロソアニリンを含む。]
[0014] 本開示において有用である好適なアルキルフェナジン四級塩は、限定されないが、式Ｉａ：]
[0015] ]
[0016] ［式中、
Ｚは、−（ＣＨ2）mＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＯＣＨ3、及び−ＯＹから成る群から選択され、ここでｍは０〜約６の整数であり、そしてＹは、以下：]
[0017] ]
[0018] （式中、ｎは約１〜約４の整数であり、Ｑは、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＯＨ、−ＮＨＣＨ2ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）o−Ｇ、−（ＣＨ2）OＮＲ2Ｒ3、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、又は−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＯＨであり、ここでＧは−ＣＯＯＨ、ＮＲ2Ｒ3、又は：]
[0019] ]
[0020] である）
から成る群から選択され、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であり、Ｒ2及びＲ3は同一又は異なり、そして各々Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、ｏは、約１〜約６の整数であり；そしてＸは、ハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択されるアニオンである］
によって表される５−アルキルフェナジンを含む。]
[0021] 本開示の第二の態様は、分析物の濃度を決定するために使用され得る化学マトリックス組成物を提供し、ここで前記化学マトリックスは、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニトロソアニリン、及び光化学的に安定であって、分析物濃度の決定に有用な５−アルキル−１−カルボキシアルコキシフェナジンを含む。カルボキシアルコキシフェナジン基における「カルボキシ基」は、カルボン酸、それらの塩、エステルのアミド、ニトリル、及び他の既知のカルボン酸誘導体を含む。特に好適な５−アルキル−１−カルボキシアルコキシフェナジンは、以下の式ＩＩａ：]
[0022] ]
[0023] ［式中、
Ｒ6は、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＯＨ、−Ｏ（ＣＨ2）mＮＨ2、及び−Ｏ（ＣＨ2）mＯＨから成る群から選択され、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であり、Ｒ2及びＲ3は、同一であるか又は異なり、そして各々、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、Ｘ-は、ハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択され、並びにｎ及びｍは、約１〜約６の整数である］
によって表される。]
[0024] 本開示の第三の態様は、分析物の濃度の分析に使用されるさらなる化学マトリックス組成物を提供する。この化学マトリックスは：
（ａ）グルコース脱水素酵素；
（ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド；
（ｃ）以下の式：]
[0025] ]
[0026] ［式中、Ｒ6は、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＮＨ2、−ＮＨ（ＣＨ2）mＯＨ、−Ｏ（ＣＨ2）mＮＨ2、及び−Ｏ（ＣＨ2）mＯＨから成る群から選択され、Ｒ2及びＲ3は、同一であるか又は異なり、そして各々、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、Ｘ-は、ハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択され、並びにｎは約１〜約６の整数であり、ｍは約１〜約６の整数である］
であるフェナジンエトサルフェート；並びに
（ｄ）以下の式：]
[0027] ]
[0028] ［式中、Ｒ10は３−ＯＣＨ3であり、並びにＲ11及びＲ12＝ＣＨ2ＣＨ2ＯＨである］
で表されるニトロソアニリン誘導体
を含む。]
[0029] この化学マトリックスにおいて、式Ｉａのフェナジンはまた、上の式ＩＩのフェナジンの代わりとなり得る。]
[0030] 本開示の第四の態様は、分析物の濃度を決定するために有用である化学マトリックス組成物を提供する。当該組成物は、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニトロソアニリン、及び光化学的に安定な１−カルボキシアルキルオキシ−５−アルキルフェナジンを含む。]
[0031] 本開示の第五の態様は、液体試料中における分析物の電気化学的分析のための方法であって、当該分析物を、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニトロソアニリン、及び光化学的に安定な１−カルボキシアルキルオキシ−５−アルキルフェナジンを含むマトリックスと反応させて、電気化学的応答を産生することができる電気活性剤(ｅｌｅｃｔｒｏ−ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ)を提供すること、電気化学的応答を産生するシグナルを提供すること、産生された電気化学的応答を測定すること、及び測定された電気化学的応答に基づいて液体試料中の分析物濃度を決定することに関連する、前記方法を提供する。この方法は通常、上記化学マトリックスの実施形態を含む、テストストリップを有するバイオセンサーの適用領域へ当該試料を適用し、そして当該化学マトリックスと反応させることによって当該分析物を定量することに関する。当該方法は、約２０ｍｇ／ｄＬ〜約６００ｍｇ／ｄＬの血液グルコースレベルを決定するときに特に有効であり、そして約５秒以下の試験時間を提供し得る。試験時間とは、試験試料のテストストリップへの適用時（又は試験試料の適用を実際に検出する時）と、試験結果が観測され、そしてバイオセンサーを用いた使用のために構成されたモニター装置のディスプレイ上に表示される時との間の時間のことである。]
[0032] 本開示の第六の態様は、液体試料中における分析物の電気化学的分析のための方法であって、当該化学マトリックスを含むテストストリップを有するバイオセンサーの適用領域へ当該試料を適用し、当該分析物を当該化学マトリックスと反応させることによって定量し、そして前記定量の結果を、前記バイオセンサーを用いた使用のために構成されたモニター装置のディスプレイ上に表示することを含み、ここで前記化学マトリックスは、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニトロソアニリン、及び以下の式：]
[0033] ]
[0034] ［式中、
Ｚは、−（ＣＨ2）mＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＯＣＨ3、及び−ＯＹから成る群から選択され、ここでｍは０〜約６の任意の整数であり得、そしてＹは、以下：]
[0035] ]
[0036] （式中、
ｎは約１〜約４の整数であり、Ｑは、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＯＨ、−ＮＨＣＨ2ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）o−Ｇ、−（ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、又は−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＯＨであり、ここでＧは、−ＣＯＯＨ、ＮＲ2Ｒ3、又は]
[0037] ]
[0038] である）
から成る群から選択され、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であり、Ｒ2及びＲ3は、同一であるか又は異なり、そして各々Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、ｏは約１〜約６の整数であり；そしてＸはハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択されるアニオンである］
で表される５−アルキルフェナジン四級塩を含む、前記方法を提供する。種々のニトロソアニリンは、本方法のための化学マトリックスにおいて利用され得るが、構造ＩＩＩによって示されたニトロソアニリンが特に安定である。]
[0039] 本開示の多くの利点及び更なる態様は、以下の好ましい実施形態、及び図の記載から明らかとなるだろう。]
図面の簡単な説明

[0040] 図１は、本開示の実施形態と共に使用されるテストストリップの第一の上面図であり、そして除去されるテストストリップのカバー層を含む。
図２は、定位置にカバー層を有する、図１のテストストリップの第二の上面図である。
図３は、実施例１に記載された新規化学マトリックスを用いて決定された、血液／グルコース応答の直線的性質を示すプロットである。
図４は、二つの酸素レベルにおける、及び約０〜約１２０ｍｇ／ｄＬのグルコースレベルにおける酸素妨害の欠如を示すプロットである。
図５は、二つの酸素レベルにおける、及び約０〜約７００ｍｇ／ｄＬのグルコースレベルにおける酸素妨害の欠如を示すプロットである。
図６は、従来のテストストリップを使用したときのマルトース妨害を、及び新規化学マトリックスに基づくテストストリップを用いた場合の妨害の欠如を示すプロットである。] 図１ 図２ 図３ 図４ 図５ 図６
[0041] 本開示の原理の理解を促進する目的のために、図において示された実施形態に対して言及がなされ、そして特定の用語は同一のことを記載するために使用されるだろう。しかしながら、本開示の範囲の限定がそれにより意図されていないことが理解されるだろう。説明された装置におけるかかる変更、及びさらなる改良、並びに本明細書中に記載された開示の原理のかかるさらなる適用は、本開示が関連する技術分野の当業者が想到するものとして、本開示の範囲内のものであると意図される。特に、当該開示は、血液グルコース計測器に関して説明されるが、本発明は他の分析物及び他の試料種を測定するための装置を用いて使用され得ることが意図されている。かかる代替的実施形態は、当業者にとって明らかである、本明細書において開示された実施形態への特定の適用を必要とする。]
[0042] 本開示は一般的に、分析物（例えばグルコース）の濃度を、関連する成分（例えばマルトース）、及び種々のレベルの関連しない成分（例えば酸素）の存在下で決定するために使用される化学マトリックスに関する。先に記載した通り、マルトースの存在、及び酸素レベル変化の両方は、種々の電気化学的バイオセンサーを用いて行われるグルコースの決定を阻害し得る。化学マトリックス及びそれに付随する方法が、血液グルコースレベルの分析に関連して以下に記載されるが、当該化学マトリックス及び記載された方法は、他の種類の分析物を同様に分析するために使用され得る。]
[0043] 本開示の実施形態は、生体液中の分析物濃度の決定における使用のための新規化学マトリックスを意図する。典型的には、新規化学マトリックス組成物の実施形態は、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フェナジン誘導体、及び／若しくはニトロソアニリン、又はその誘導体を含む。当該化学マトリックスの異なる実施形態は、電気化学的バイオセンサーと共に使用されて、反応が当該バイオセンサー中で生じた後に分析物の濃度を決定する。フェナジン誘導体の実施形態は、光化学的に安定なフェナジン誘導体、例えば１−置換−５−アルキルフェナジン四級塩を含む。さらなる実施形態が同様に意図される。開示された化学マトリックスの実施形態を使用して、分析物の濃度を決定するための方法は、本開示の別の態様である。当該方法、例えば、約２０ｍｇ／dＬ〜約６００ｍｇ／dＬの血液グルコースレベルを、約５秒以下で決定し得る。当該化学マトリックスは、ｐＨ約６．５〜約８．５で良好に機能し得る。]
[0044] 当該新規化学マトリックスは、本明細書において詳細に完全に記載される。新規化学マトリックスの成分は、酵素、補助因子、試薬、及びメディエーターを含み得る。実施されるとき、当該酵素はグルコース脱水素酵素であり得、当該補助因子はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドであり得、当該試薬はフェナジン誘導体であり得、そして当該メディエーターはニトロソアニリンであり得る。フェナジン誘導体の実施形態は、５−アルキルフェナジン四級塩を含む。米国特許第５，１２２，２４４号、及び第５，２８６，３６２号明細書（上で参照されている）においてより完全に記載及び説明されるように、ニトロソアニリン分子が、電気化学的分析物検出及び測定法において通常行われる電子媒介シークエンスにそれ自体直接的に関与せず；むしろニトロソアニリンは、グルコース及び化学マトリックスの他の成分と反応して、１回又は２回除去される電気活性反応産物（通常の媒介シークエンスにおいて直接的に関与する電気活性反応産物）を産生するシークエンスに加わるという点において、ニトロソアニリンは、間接的電子メディエーターの一例である。先の記載にもかかわらず、ニトロソアニリンは、電気化学的メディエーターシークエンスに直接的に関与する当該メディエーターの前駆体であると理解されると共に、ニトロソアニリン及び／又はその誘導体は、本明細書及び出願人によって与えられ及び／又は準備された他の参照においてメディエーターと呼ばれ得る。]
[0045] フェナジン誘導体
要求されていないが、好適なフェナジン誘導体は通常、当該誘導体が光の存在下、及び特にｐＨ約７〜約８．５で安定であるように選択される。好適なフェナジン誘導体は、５−アルキルフェナジン四級塩、例えば、上記式Ｉａで示される種類の５−アルキル−１−置換フェナジン四級塩、並びに以下：]
[0046] ]
[0047] ［式中、
Ｒ6は、−ＯＨ、−ＯＲ1、ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＯＨ、−Ｏ（ＣＨ2）mＮＨ2、及び−Ｏ（ＣＨ2）mＯＨから成る群から選択され、Ｒ1はＣ1〜Ｃ6アルキル基であり、Ｒ2及びＲ3は同一であるか又は異なり、そして互いにＨ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、Ｘ-はハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択されるアニオンであり、並びにｎ及びｍは、約１〜約６の整数である］
で提供される，式ＩＩａ及びＩＩｂで示される種類の５−アルキル−１−置換フェナジン四級塩を含む。]
[0048] ニトロソアニリン
ニトロソアニリンは、一般式III：]
[0049] ]
[0050] ［式中、
Ｒ10は、水素、ハロゲン、アルコキシ又はアルキルチオを示し、及びＲ11はアルキル又はヒドロキシアルキル基を示し、及びＲ12はヒドロキシアルキル基を示し、或いはＲ11及びＲ12は同一であるか又は異なり、そして各々、場合によりアルキル基がＯＨによって置換された、ジアルキルアミノアルキル基、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、若しくはアルコキシアルキルであり、又は場合によりアルキル基がヒドロキシ基で置換されたポリアルコキシアルキル基であり、或いはＲ11及びＲ12は硫黄又は窒素によって中断されるアルキレン基を形成し、ここで前記窒素は、アルキル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アルコキシヒドロキシアルキル、ジオキサニリル−アルキル、又はポリアルコキシアルキル基によって置換され、そしてそれらの各々はそれ自身、アルキル基がヒドロキシ基によって場合により置換され、或いは、Ｒ10がＮＲ11Ｒ12に対してオルト位に位置する場合、Ｒ11はまた、Ｒ10と一緒になってアルキレン基を示し、ここでＲ12はヒドロキシアルキル基を示し、又は、当該アルキレン基が３個の炭素原子を含む場合、それはまた、場合によりアルキル基を示す］
で表される。この関連で、ハロゲンはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素を示す。フッ素及び塩素は、Ｒ10において典型的なハロゲンである。アルキル、アルコキシ又はアルキルチオは、１〜６個の炭素原子を有する基であり、ここで１〜３個の炭素原子を含むものが特に好適である。前述のアルキルの定義はまた、ヒドロキシアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ヒドロキシアルコキシ−アルキル、アルコキシアルキル、ポリアルコキシアルキル、アルコキシ−ヒドロキシアルキル、及びジオキサニリル−アルキル基におけるアルキル基に適用される。]
[0051] ジオキサニリル-アルキル基は、ジオキサン環系がアルキル基と結合している基である。それは通常、１，４−ジオキサン環系、すなわち、以下である。]
[0052] ]
[0053] ポリアルコキシアルキル基は、−アルキル−（アルコキシ）p−アルコキシ基であり、ここでｐは１〜１０である。通常、ｐは１〜４であり；そしてより典型的にはｐは１〜３である。]
[0054] アルキレン基は、直鎖又は分岐鎖の基であり、好ましくは直鎖であり、そして飽和又は不飽和のいずれかであり、例えば、２〜５個の、好ましくは２〜４個の炭素原子から成る、２つの遊離の結合部位を有する飽和炭化水素鎖である。]
[0055] Ｒ11及びＲ12から形成される、硫黄又は窒素によって中断されるアルキレン基の意味中おいて、窒素原子の含有によって形成される、チオモルホリン又はピペラジン基が好適である。ピペラジン基は特に好適である。]
[0056] Ｒ11及びＲ12から形成されるアルキレン基の意味中おいて、一般式Ｖの芳香族環の含有によって形成されるインドリン、又は１，２，３，４−テトラヒドロキノリン基が好適である。]
[0057] ]
[0058] 一般式ＩＩＩの、本開示のニトロソアニリン誘導体の塩として、強酸塩、特に鉱酸、例えば塩酸、硫酸、硝酸、及びリン酸が好適である。塩酸塩が特に好適である。]
[0059] 以下の新規ニトロソアニリン誘導体が、本化学マトリックスの特に好適な成分である：
ａ）２，２’−［（３−フルオロ−４−ニトロソフェニル）イミノ］ビス−エタノール、
ｂ）２，２’−［（３−クロロ−４−ニトロソフェニル）イミノ］ビス−エタノール、
ｃ）２，２’−［（３−メトキシ−４−ニトロソフェニル）イミノ］ビス−エタノール、
ｄ）２，２’−［（３−メチルメルカプト−４−ニトロソフェニル）イミノ］ビス−エタノール、
ｅ）２−［（２−ヒドロキシエトキシ）エチル−（４−ニトロソフェニル）アミノ］エタノール、
ｆ）２−［（２−メトキシエトキシ）エチル−（４−ニトロソフェニル）アミノ］エタノール、
ｇ）１−［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−（４−ニトロソアニリノ）］−３−メトキシ２−プロパノール、
ｈ）１−［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−（４−ニトロソアニリノ）］−３−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−プロパノール、
ｉ）１−メチル−４−（４−ニトロソフェニル）−ピペラジン、
ｊ）４−（４−ニトロソフェニル）−１−ピペラジノ−エタノール、
ｋ）５−ニトロソ−１−インドリンエタノール，
１）１−メチル−６−ニトロソ−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン、
ｍ）６−ニトロソ−３，４−ジヒドロ−１（２Ｈ）キノリンエタノール、及びそれらの塩、
ｎ）２−［（２−ヒドロキシエチル−４−ニトロソフェニル）アミノ］エタノール。]
[0060] これらの化合物の中で、ａ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）及びｈ）、並びにそれらの塩が特に好適である。化合物ｅ）又はその塩、特に塩酸塩が特に好適である。]
[0061] フェナジン成分の製造
化学マトリックスにおける成分の一つは、フェナジン誘導体を含む。フェナジン誘導体は、種々の異なる置換フェナジンから選択され得るが、５−アルキル，１−置換フェナジンが本開示において有用であり、最も好ましくは５−エチル−１−置換フェナジンである。５−アルキル化フェナジンの１位における種々の異なる連結基が好適である。好適な置換フェナジンは、以下：]
[0062] ]
[0063] ［式中、
Ｚは、−（ＣＨ2）mＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＯＣＨ3、及び−ＯＹから成る群から選択され、ここでｍは０〜約６の整数であり、そしてＹは、以下：]
[0064] ]
[0065] （式中、
ｎは約１〜約４の整数であり、Ｑは、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＯＨ、−ＮＨＣＨ2ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）o−Ｇ、−（ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、又は−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＯＨであり、ここでＧは、−ＣＯＯＨ、ＮＲ2Ｒ3、又は]
[0066] ]
[0067] である）
から成る群から選択され、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であり、Ｒ2及びＲ3は、同一であるか又は異なり、そして各々Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、ｏは約１〜約６の整数であり；そしてＸはハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択されるアニオンである］
で提供される、構造Ｉａを含む。]
[0068] 特に好適なフェナジン誘導体は、以下：]
[0069] ]
[0070] ［式中、
Ｒ6は、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＯＨ、−Ｏ（ＣＨ2）mＮＨ2、及び−Ｏ（ＣＨ2）mＯＨから成る群から選択され、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であり、Ｒ2及びＲ3は、同一であるか又は異なり、そして各々、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、Ｘ-は、ハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択され、並びにｎ及びｍは、約１〜約６の整数である］
で提供される式ＩＩａによって示され得る。]
[0071] 以下の反応スキーム１〜９は、好適なフェナジン誘導体を製造するために使用され得る幾つかの典型的な反応経路を示す。]
[0072] ]
[0073] スキーム１は、５−エチル−１−アルコキシカルボン酸フェナジン誘導体（５）の合成を示す。本化合物の製造は、文献に記載されている［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１７９，２９３−２９８（１９８９）を参照］。しかし、当該合成手順は、必要な量の置換フェナジン（５）を提供するために広範囲に改良された。]
[0074] １−ヒドロキシフェナジン（１）は、ＴＣＩアメリカから購入された。これを、炭酸カリウム、及び１８−クラウン６の存在下、アセトン中、還元条件下でエチル４−ブロモブチレートと反応させてフェナジンエチルエステル（３）を得た。文献に記載されたフェナジンエチルエステル（３）と硫酸ジエチルとの反応は、Ｎ−アルキル化産物を提供しなかった。フェナジンエチルエステル（３）のＮ−アルキル化のための反応工程は、塩基、例えば炭酸カリウムを加えることによって調べられた。したがって、炭酸カリウムの存在下、１００℃で１８時間でのフェナジンエチルエステル（３）と硫酸ジエチルとの反応は、５−Ｎ−エチル１−置換カルボン酸エチルエステルフェナジン誘導体（４）を提供した。生じた５−Ｎ−エチルフェナジンエチルエステルを希塩酸によって加水分解して、５−エチル−１−カルボキシブチルフェナジン誘導体（５）を得た。]
[0075] ]
[0076] スキーム２は、フェナジンの溶解性に影響を与え得る親水性リンカーを有する、１−アルコキシ−置換フェナジン誘導体（９）の合成を示す。親水性置換フェナジンの利用可能性は、より広い範囲のマトリックス製剤を可能とする。５−Ｎ−エチルフェナジン１−ヒドロキシブタン酸誘導体（５）を１−エチルＮ−３，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、対応するＮ−ヒドロキシスクシンイミドを得た。この活性化エステルを、三級塩基、例えばトリエチルアミンの存在下、市販のアミノｄ−ＰＥＧ4メチルエステル（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，ＵＳＡ）と反応させた。メチルエステルの脱保護は文献に記載された通りである（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐ．，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，第二版，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９１を参照）。メチルエステル基は、酸又は塩基の存在下で脱保護されて、ＰＥＧリンカーを有するフェナジン誘導体（９）を得ることができる。希塩酸を用いたメチルエステルの加水分解は、このフェナジン化学系において特に好適であることが明らかとなった。]
[0077] ]
[0078] スキーム３は、二量化したフェナジン誘導体（１１）の合成を示す。フェナジン誘導体（１１）を含む化学マトリックスは通常、改善された感受性を提供する。フェナジン誘導体（１１）は、三級アミン、例えばトリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンの存在下、溶媒、例えばジメチルホルムアミド、又はテトラヒドロフラン中、０℃〜室温で、活性エステル（６）を、２，２−（エチレンジオキシ）ビスエチルアミド（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）と反応させることによって製造され得る。特に好適な塩基／溶媒の組み合わせは、トリエチルアミン／ジメチルホルムアミドを含む。]
[0079] ]
[0080] スキーム４は、アミノ終結された１−置換Ｎ−エチルフェナジンの合成を示す。１−ヒドロキシフェナジンのＯ−アルキル化は、末端アミノ保護アルキル化剤、例えばフタルイミド、又はｔ−ＢＯＣ誘導体を使用して行われ得る。生じるｔ−Ｂｏｃ保護アミンは、酸性条件、例えばトリフルオロ酢酸存在下で脱保護され得るが、生じるフタルイミド保護されたアミンは、ヒドラジン又はメチルアミンの存在下で脱保護され得る。特に好適な方法は、塩基、例えば炭酸カリウムの存在下、溶媒、例えばアセトン、ＤＭＦ、又はＴＨＦ中、還流条件下で、１−ヒドロキシフェナジンを、Ｎ−（４−ブロモブチル）フタルイミド（Ａｃｒｏｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）と共に反応させることを含む。アセトンが、この反応のために特に好適な溶媒であることが明らかとなった。生じたアルキル化産物（１３）は、炭酸カリウムの存在下、硫酸ジエチルと反応させて、Ｎ−エチルフタルイミド保護フェナジン（１４）を得る。フタルイミド基は、メタノール中、室温でメチルアミンを用いて脱保護されて、アミノ終結された１−置換Ｎ−エチルフェナジン（１５）を得る。]
[0081] ]
[0082] スキーム５は、末端がヒドロキシルである、１位置換フェナジン誘導体の合成を示す。１−ヒドロキシフェナジン（１）を、ヒドロキシ保護されたアルキル化剤、例えば、（３−ブロモプロポキシ）−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン（１６）（Ａｌｄｒｉｃｈ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）と、炭酸カリウム存在下、アセトン中、還流条件で反応させて、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン（ＴＢＤＭＳ）保護されたフェナジン誘導体（１７）を得る。（１７）のＮ−アルキル化を、硫酸ジエチルを用いて炭酸カリウム存在下で行い、末端ヒドロキシルが保護されたＮ−エチル１−置換フェナジン誘導体（１８）を得た。ＴＢＤＭＳ基の脱保護を、ＴＨＦ中、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）の存在下、室温で行い、１−ヒドロキシブチルＮ−エチルフェナジン（１９）を得た。]
[0083] ]
[0084] スキーム６は、Ｎ−エチルフェナジン１−ヒドロキシブチルメチルエーテルの合成を説明する。フェナジンエーテル（２１）は、１−ヒドロキシフェナジン（１）を、４−メトキシブチルブロミド（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を用いてアルキル化してフェナジン誘導体（２１）を得ることによって製造される。Ｎ−エチルフェナジン（２２）は、炭酸カリウムの存在下、化合物（２１）を硫酸ジエチルと反応させることによって製造される。]
[0085] ]
[0086] 反応スキーム７は、１−カルボキシＮ−エチルフェナジン（２９ａ）、及び８−メチル１−カルボキシＮ−エチルフェナジン（２９ｂ）誘導体の合成を説明する。アニリン（又はオルトトルイジン）、及び２−ブロモ−３−ニトロ安息香酸の混合物を、ＣｕＣｌ、Ｃｕ粉末、及びＮ−エチルモルホリンの存在下、ブタン−２，３−ジオール中、７０〜８０℃で８〜２４時間反応させる。この反応混合物を、０．１Ｍ ＮＨ4ＯＨ溶液で希釈し、そしてセライト床を通じてろ過する。生じた溶液をゆっくりと２Ｎ ＨＣｌへと注ぎ、Ｎ−フェニル−３−ニトロアントラニル酸（２５ａ）、又はメチル置換誘導体（２５ｂ）を得る。２Ｎ ＮａＯＨ溶液中、還流下、中間体（２５ａ）又は（２５ｂ）を水素化ホウ素ナトリウムと反応させ、閉環し、そしてフェナジンのナトリウム塩を得、それを酸性化して（２６ａ）又は（２６ｂ）を得る。フェナジン１−カルボキシ誘導体（又は８−メチル１−カルボキシフェナジン）の酸塩化物は、塩化チオニルとの反応により製造され、そして生じる酸塩化物を、ＨＣｌ−メタノール溶液との反応によってメチルエステルへと変換する。生じるフェナジンメチルエステル（２７ａ）又は（２７ｂ）は、硫酸ジエチル及び炭酸カリウムを用いてアルキル化されて、対応するＮ−エチルフェナジン誘導体（２８ａ）又は（２８ｂ）を得る。最後に、フェナジン（２８ａ）又は（２８ｂ）のメチルエステル基を希塩酸で加水分解して、（２９ａ）又は（２９ｂ）を得る。]
[0087] ]
[0088] スキーム８は、１−アセトアミド−Ｎ−エチルフェナジン誘導体（３５）の合成経路を提供する。３−アミノ−カテコール塩酸塩（３０）を、酢酸エチル中、酸化銀及び無水硫酸ナトリウムと反応させて、３−アミノ−１，２−キノン（３１）を得、そしてそれをｉｎ ｓｉｔｕでオルトフェニレンジアミン（３２）とさらに反応させて、１−アミノフェナジン（３３）を得る。アミノフェナジン（３３）を、酢酸中、無水酢酸を用いてアセチル化して、１−アセトアミドフェナジン（３４）を得る。生じる１−アセトアミドフェナジンを、炭酸カリウムの存在下、硫酸ジエチルと反応させてＮ−エチル−１−アセトアミド−フェナジン（３５）を得る。]
[0089] ]
[0090] スキーム９は、１−カルボキシメチル５−Ｎ−エチルフェナジン誘導体（４２）の合成経路を提供する。ブロモ誘導体（３７）は、過安息香酸及び溶媒の存在下、１−メチルフェナジン（３６）（Ａｐｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＫから市販されている）をＮ−ブロモスクシンイミドと反応させることによって形成される。四塩化炭素は、ブロモ化反応に特に好適な溶媒である。ブロミド（３７）をＫＣＮと好適な溶媒、例えばＤＭＦ中で反応させることにより、１−シアノメチルフェナジン誘導体（３８）を得る。シアノフェナジン（３８）の酸加水分解は、１−カルボキシメチルフェナジン（３９）を提供する。化合物（３９）の酸基をメタノール及びＨＣｌとの反応によってメチルエステルへと変換して、フェナジンエステル（４０）を得る。エステル（４０）を、硫酸ジエチルを用いて炭酸カリウムの存在下でＮ−アルキル化して、５−エチルフェナジンエステル（４１）を得ることができる。当該エステルを、希塩酸を用いて加水分解して５−エチル−１−カルボキシメチルフェナジン（４２）を得る。]
[0091] ニトロソアニリン成分の製造
一般式ＩＩＩの化合物は、一般式ＶＩ（式中、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、一般式ＩＩＩの化合物と同一の意味を有する）の化合物を亜硝酸塩と反応させることによって製造され得る。式ＩＩＩに関する詳細は、上記の通りである。]
[0092] ]
[0093] 類似の製法が、Ｊ．Ｊ．Ｄ’Ａｍｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，５９５７（１９５９）から既知である。]
[0094] 亜硝酸アルカリ金属塩は通常、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、又はセシウムがアルカリ金属として可能である亜硝酸塩として使用され；亜硝酸ナトリウム及び亜硝酸カリウムが特に好適である。亜硝酸ナトリウムが著しく好適である。反応は通常、低温で酸溶媒中にて行われる。温度が１０℃未満であるとき、好ましくは−１０℃〜＋５℃の時が有利である。]
[0095] 一般式ＶＩの化合物と亜硝酸塩との反応が水性溶媒中で行われるときが有利である。当該溶媒の好適なｐＨ３未満であり、そして２未満が特に好適である。]
[0096] 当該反応のための一つの実施形態において、一般式ＶＩの化合物又はその塩、例えば鉱酸、例えば塩酸、硫酸、硝酸又はリン酸の塩は、水性酸溶媒へと最初に加えられ、そして冷却される。]
[0097] その後、通常は溶解形態である亜硝酸塩を、当該反応混合物を低温で維持しながら加える。水性溶媒がまた、亜硝酸塩のための溶媒として使用されるときが有利である。当該亜硝酸塩の添加後、反応が完了するまで反応混合物を低温で維持する。当該反応混合物を処理するために、それは通常、有機溶媒を用いて抽出され、そして製造物を当該抽出液から単離する。]
[0098] 化学マトリックス
化学マトリックスの第一の実施形態は、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、５−エチルフェナジン四級塩、及びニトロソアニリンを含む。必要とされないが、好適な四級塩は通常、光化学的に安定である。光化学的に安定な５−エチル四級塩の例は、式Ｉａ：]
[0099] ]
[0100] ［式中、
Ｚは、−（ＣＨ2）mＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＯＣＨ3、及び−ＯＹから成る群から選択され、ここでｍは０〜約６の整数であり、並びにＹは、以下：]
[0101] ]
[0102] （式中、
ｎは約１〜約４の整数であり、Ｑは、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＯＨ、−ＮＨＣＨ2ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）o−Ｇ、−（ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、及び−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＯＨであり、ここでＧは、−ＣＯＯＨ、ＮＲ2Ｒ3、又は：]
[0103] ]
[0104] である）
から成る群から選択され、Ｒ1はＣ1〜Ｃ6アルキル基であり、Ｒ2及びＲ3は、同一であるか又は異なり、そしてそれぞれＨ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、ｏは約１〜約６の整数であり；並びにＸは、ハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択されるアニオンである］
並びに式ＩＩｂ：]
[0105] ]
[0106] ［式中、
Ｒ6は、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＯＨ、−Ｏ（ＣＨ2）mＮＨ2、及び−Ｏ（ＣＨ2）mＯＨから成る群から選択され、Ｒ1はＣ1〜Ｃ6アルキル基であり、Ｒ2及びＲ3は同一であるか又は異なり、そして各々Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、Ｘ-は、ハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択されるアニオンであり、そしてｎ及びｍは約１〜約６の整数である］
によって示される。]
[0107] 化学マトリックスのさらなる実施形態は、上で提供された、式ＩＩａ又はＩＩｂで示される式で表されるフェナジンアルキル四級塩を含む。好適な四級塩は通常、光化学的に安定であり、そしてｐＨ約６．５〜約８．５で安定である。本実施形態のさらなる成分は、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、及び／又はニトロソアニリンを含み得る。好適なニトロソアニリンは、上で提供された式ＩＩＩによって表される。]
[0108] 化学マトリックスのなおさらなる実施形態は、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、上で提供された、式ＩＩｂによって表される５−エチルフェナジン四級塩、及び式ＶＩＩ：]
[0109] ]
[0110] によって表される１，４−ニトロソアニリンを含む。]
[0111] 好適なフェナジン四級塩は通常、光化学的に安定である。]
[0112] 化学マトリックス組成物のなおさらなる実施形態は、光化学的に安定な５−アルキルフェナジン四級塩を含む。当該組成物は、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、及びニトロソアニリンを追加的に含み得る。好適なフェナジン四級塩は、上で提供された式Ｉによって表される。好適なニトロソアニリンは、上で提供された式ＩＩＩによって表される。]
[0113] 別の実施形態は、化学マトリックスの実施形態を利用して、分析物試料（特に、血液中のグルコース）の濃度を決定するための方法又は試験を含む。当該方法は、先に記載されたバイオセンサー及びテストストリップの構成を使用することを含む。化学マトリックスは、分析物の濃度を決定するための化学反応において使用される。特定の方法は、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、５−アルキルフェナジン四級塩、及びニトロソアニリンを含む化学マトリックスを利用する。特定の他の方法は、式ＩＩｂによって表される５−アルキルフェナジン四級塩を利用し、そしてさらなる他の方法は、式ＶＩＩによって表されるニトロソアニリンを利用する。本明細書に記載された方法は、約５秒以下の試験時間にて、約２０ｍｇ／dＬ〜約６００ｍｇ／dＬの血液グルコースを含む試料を分析するために使用され得る。最適な結果は、ｐＨ約６．５〜約８．５で化学マトリックスを利用するときに得ることができる。]
[0114] 図への言及は、本開示の態様をさらに開示する。本明細書に記載された化学及び方法を用いた使用に好適である、電流測定電気化学的分析物センサー２０は、図１及び２に示される。図１及び２のセンサー２０は、センサーの一様式の例に過ぎず、それは本発明に従う化学及び方法と共に使用され得、そして異なる構成を有するセンサーの他の様式が同様に使用され得ることが認識されるべきである。例えば、図１及び２で示されたセンサーは、相互嵌合アレイ中で形成された電極を有するが、異なる構成を有するセンサー、又は追加の電極を有するセンサーが、開示された化学マトリックスと共に、及び開示された方法を用いて使用され得る。別の例として、示された実施形態中の電極は、同一平面上に配置されているが、他の実施形態における電極２２が、他の配置、例えば対面の構成を有し得ることが理解されるべきである。簡潔かつ明確性のために、センサー系の特徴の必ずしも全てが以下に詳細に記載されてはいないが、米国特許第５，９８９，９１７号、第６，２７０，６３７号、及び出願公開された米国特許出願番号第２００３／０１５５２３７Ａｌ号明細書第号明細書に記載されたもの（それらの全てが、それら全体において参照により本明細書に組み込まれる）を含めて、それを用いた発明の化学及び方法が有用である、他の様式のセンサーの例について参照がなされる。] 図１
[0115] 図１において、センサー２０は、柔軟性基材２４上に配置された電極２２の相互嵌合アレイを含む。対となった電極２２の一方は作用電極として作用し、そして他方の電極は対電極として作用する。しかし、先に示されたとおり、本開示の一つの実施形態の電極２２は、役割を変更し得る。すなわち電極２２は、ある時は作用電極として作用し得、そして別の時には対電極として作用し得る。記載された実施形態において、２つの電極２２が示されるが、他の実施形態におけるセンサー２０はより多くの電極を含み得ることが認識されるべきである。電極２２は、柔軟性基材２４の表面に配置された導体パッド（ｃｏｎｔａｃｔ ｐａｄ）２８を含む、導電性コネクター２６と接続され、ここで前記導体パッド２８は、外部電子回路、例えば測定器へと接続するために利用される。前記コネクター２６はまた、コネクター部３０を含み、そしてそれは、前記アレイ２２における電極素子を前記パッド２８へと接続し、そして通常、絶縁層によって遮蔽されて得る。] 図１
[0116] 図２において、非導電性スペーサー層３２が、前記基材２４、及び前記コネクター２６のコネクター部３０に配置される。前記スペーサー層３２は、キャピラリー試料容器３４の境界を明確化し、そして前記試料容器３４は、液体試料が前記試料容器３４へと出される、注入穴を有する。試薬層３５は、前記試料容器３４内の前記アレイ２２に配置される。前記試薬層３５は、以下にさらに詳細に記載されるが、前記液体試料を分析するために形成される。ホイル３６は、空気穴３８を除くキャピラリー容器３４の一部、及び前記スペーサー３２を覆い、そして前記空気穴は前記容器３４から空気を放出するために使用される。] 図２
[0117] マトリックス溶液の調製
標準マトリックス溶液
２５．１４８ｇのＰＩＰＥＳ１．５ナトリウム塩、０．１２５ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及び２．４０ｇのトレハロースを、４００ｍＬの再蒸留水へ加え、そして溶液のｐＨを７．００へと調節することによって、ストック緩衝溶液を調製した。この溶液を５００ｍＬの容量フラスコに加え、そして再蒸留水で希釈して５００ｍＬの溶液とした。３９６グラムの先の緩衝溶液を、２ｇのポリエチレンオキシド（３００Ｋ）及び２ｇのＮａｔｒｏｓｏｌ ２５０Ｍと混合することにより、緩衝／ポリマー溶液の調製を行った。一晩放置すると全ての固体が溶解し、そして当該溶液は使用できる状態となった。]
[0118] （ａ）以下の成分を２５ｍＬの高速混合（ｓｐｅｅｄ ｍｉｘｉｎｇ）カップへと連続的に加え、そして各々の添加後に３３，０００ｒｐｍで１分間高速混合し：０．５５９２ｇのＫＣｌ、０．１８２４ｇのＮＡＤグレード１、及び０．０９１３ｇの置換ニトロソアニリン（構造ＶＩＩ）；（ｂ）ｐＨを７．０に調節し；そして（ｃ）０．０１６３ｇの１−（３−カルボキシプロピルオキシ）−５−エチルフェナジン（スキーム１の５）を容器へ加え、３３，０００ｒｐｍで１分間混合し、そして最後に０．６５７４ｇのグルコース脱水素酵素を加え、そして３３，０００ｒｐｍで１分間高速混合することにより、マトリックス溶液を当該ストック緩衝溶液から調製した。]
[0119] 別のフェナジンを利用する、追加のマトリックス溶液
１−（３−カルボキシプロピルオキシ）−５−エチルフェナジンの代わりに別の１−置換フェナジン誘導体を用いて、又は式ＶＩで表されるニトロソアニリンの代わりに別のニトロソアニリンを同様に使用することによって、上で提供された方法を利用して、マトリックス溶液は同様に調製され得る。好適なフェナジン誘導体は通常、光化学的に安定である。式ＩＩで示される１−エチル−５−置換フェナジン四級塩はより好適であり得るが、式Ｉによって示される他の１−アルキル−５−置換フェナジン四級塩が同様に利用され得る。]
[0120] 別のニトロソアニリンを利用する、追加のマトリックス溶液
式ＶＩＩによって表されるニトロソアニリンの代わりに、式ＩＩＩによって表されるニトロソアニリンを用いることによって、上で提供された方法によって、マトリックス溶液が同様に調製され得る。]
[0121] テストストリップの製造
スペーサー及びキャピラリー構造を有する、ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ（登録商標）Ａｖｉｖａブランド電極のカードは、各々の電極チャンネルにおいて約１．８μＬの上記の基本マトリックス溶液で満たされ、そして約４５℃で約１分間乾燥された。乾燥されたカードは乾燥雰囲気下で一晩貯蔵され、そして親水性上部ホイルのストリップが、スペーサー層上に手作業でラミネート加工された。当該カードを切断して好適なストリップとし、そして使用されるまで乾燥された容器中に貯蔵した。この方法は、上記の幾つかのマトリックス容器に基づいた試験ストリップを製造するために同様に使用され得る。]
[0122] 血液用量応答試験
７つの異なるレベルのグルコースを含有する全血液試料（約５０〜約６００ｍｇ／ｄＬ）が測定された。基本マトリックス溶液から調製された試験ストリップを利用して、約２．５秒の遅延時間（ｄｅｌａｙ）、及び約２．５秒の読み込み時間（ｒｅａｄ）（試料を試験ストリップと接触させた後に約２．５秒間シグナルが適用されること、及びシグナル適用後約２．５秒間読み込みがなされることを意味する）を利用して、測定された。試料を試験ストリップへ接触させた後約５秒間、平均電流量を測定し、電流とグルコース濃度との間に直線的関係が提供された。グルコース濃度と電流量の読み込みとの間の直線的関係の確定は、分析物、例えばグルコースを分析するための化学マトリックスの利用を促進する。当該結果は、図３において提供される。同様の結果が、上記の幾つかのマトリックス溶液から調製された試験ストリップを利用して得られる。] 図３
[0123] 異なる酸素レベルにおけるマトリックスの性能
約０〜約１１０ｍｇ／ｄＬのグルコースレベルを有する血液グルコース試料を、約３９ｍｍＨｇ及び約１００ｍｍＨｇの酸素で飽和し、そしてグルコースレベルを、基本マトリックス溶液から調製された上記の試験ストリップを使用して決定した。約３秒の遅延時間及び約２秒間の読み込み時間で当該試料を測定した。約５秒における平均電流量が決定され、そしてプロットされた。図４で提供されたプロットに示される通り、酸素レベルはグルコース測定に影響を与えなかった。上記の別のマトリックス溶液から調製された試験ストリップを用いて本実施例を繰り返した時、同様の結果が得られた。] 図４
[0124] 後の試験において、約５０〜約６００ｍｇ／ｄＬのグルコースレベルを有する血液試料が約４２ｍｍＨｇの酸素、及び約１３５ｍｍＨｇの酸素を用いて飽和され、そして基本マトリックス溶液から上で調製された試験ストリップを使用してグルコースレベルが測定された。図５で示された通り、酸素レベルは、このより広い濃度範囲におけるグルコース測定に影響を与えなかった。上記の別のマトリックス溶液から調製された試験ストリップを用いて本実施例を繰り返した時、同様の結果が得られた。] 図５
[0125] マルトース妨害試験
２１ｍＭのマルトースを２００ｍＬの生理食塩水溶液へ加えることによって、マルトースストック溶液を調製した。約１０〜約５５０ｍｇ／dＬのグルコースレベルを含む６つの血液試料を調製した。各々の試料を２つに分け、そして各々１ｍＬの試験試料のために、一つの系列の試料へ０．０５ｍＬのマルトースのストック溶液を加えた。第二の系列の試料へ、等しい容量の生理食塩水溶液を加えて、１ｍＬ分の試験試料とした。試料のグルコース含有量は、標準ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ（登録商標）Ａｖｉｖａブランド試験ストリップ、及び一般的に同様の構造要素を有するが、上記新規化学マトリックスを含有する試験ストリップを用いて決定した。図６に示される通り、マルトースは、標準ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ（登録商標）Ａｖｉｖａブランドストリップを用いてなされた測定を誇張したが、新規化学マトリックスを用いてなされた決定は、マルトースを含有しない試料と実質的に同一であった。上記の別のマトリックス溶液から調製された試験ストリップを用いて本実施例を繰り返した時、同様の結果が得られた。ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ（登録商標）、及びＡｖｉｖａは、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｓａｎｄｈｏｆｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １１６，Ｄ−６８３０５ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙの米国登録商標である。] 図６
[0126] 本開示は、図及び先の記載において詳細に説明され及び記載されているが、実例と同一であると考えられ、その性格上限定的なものではなく、選択された実施形態のみが示され及び記載されていると理解されるべきであり、そして先に記載され、及び／又は以下の特許請求の範囲によって規定された開示の趣旨の範囲内にある、全ての変化、改良、及び同等物について保護されることが所望であることが理解されるべきである。さらに、本明細書において引用された全ての刊行物は、当業者の水準を示唆するものであり、そしてそれは、あたかも各々が個々に参照により組み込まれ、及び完全に説明されるように、全体として参照により本明細書に組み込まれる。]
[0127] 以下は、本発明の好ましい実施形態のリストである：]
[0128] １、分析物濃度の決定において有用である化学マトリックス組成物であって、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、５−アルキルフェナジン四級塩、及びニトロソアニリンを含み、ｐＨ約６．５〜約８．５で安定であり、そして光化学的に安定である、前記化学マトリックス組成物。]
[0129] ２、前記５−アルキルフェナジン四級塩が、式：]
[0130] ]
[0131] ［式中、
Ｚは、−（ＣＨ2）mＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＯＣＨ3、及び−ＯＹから成る群から選択され、ここでｍは０〜約６の整数であり、そしてＹは、以下：]
[0132] ]
[0133] （式中、ｎは約１〜約４の整数であり、Ｑは、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＯＨ、−ＮＨＣＨ2ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）o−Ｇ、−（ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、又は−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＯＨであり、ここでＧは−ＣＯＯＨ、ＮＲ2Ｒ3、又は：]
[0134] ]
[0135] である）
から成る群から選択され、Ｒ1はＣ1〜Ｃ6アルキル基であり、Ｒ2及びＲ3は同一であるか又は異なり、そして各々Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、ｏは、約１〜約６の整数であり；そしてＸは、ハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択されるアニオンである］
で表される化合物である、好ましい実施形態１に記載の組成物。]
[0136] ３、前記ニトロソアニリンが、式：]
[0137] ]
[0138] ［式中、
Ｒ10は、水素、ハロゲン、アルコキシ又はアルキルチオを示し、
Ｒ11はアルキル又はヒドロキシアルキル基を示し、及び
Ｒ12はヒドロキシアルキル基を示し、或いは、
Ｒ11及びＲ12は同一であるか又は異なり、そして各々、ジアルキルアミノアルキル基、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、又はアルコキシアルキル基を表し、或いは、
Ｒ11及びＲ12は、硫黄、窒素、又は置換された窒素基によって中断されるアルキレン基を形成し、或いは、
Ｒ10がＮＲ11Ｒ12に対してオルト位に位置する場合、Ｒ11はまた、Ｒ10と一緒になってアルキレン基を表し、ここでＲ12はヒドロキシアルキル基を表し、或いは、
Ｒ10及びＲ12は同一であるか又は異なり、そして各々ヒドロキシアルキル基を表す］
で表される化合物、又はその塩である、好ましい実施形態１の組成物。]
[0139] ４、Ｒ1がＣ2Ｈ5である、好ましい実施形態２の化学マトリックス。]
[0140] ５、前記ニトロソアニリンが、式：]
[0141] ]
[0142] で表される、好ましい実施形態４の化学マトリックス。]
[0143] ６、Ｚが−Ｏ−（ＣＨ2）3ＣＯＨである、好ましい実施形態５の化学マトリックス組成物。]
[0144] ７、Ｚが−Ｏ−（ＣＨ2）4ＣＯ−ＮＨＣＨ2ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）4−ＣＯＯＨである、好ましい実施形態５の化学マトリックス組成物。]
[0145] ８、Ｚが−Ｏ−（ＣＨ2）4−ＮＨ2である、好ましい実施形態５の化学マトリックス組成物。]
[0146] ９、Ｚが−Ｏ−（ＣＨ2）3−ＯＨである、好ましい実施形態５の化学マトリックス組成物。]
[0147] １０、Ｚが−Ｏ−（ＣＨ2）4−ＯＣＨ3である、好ましい実施形態５の化学マトリックス組成物。]
[0148] １１、Ｚが−（ＣＨ2）ＣＯＯＨである、好ましい実施形態５の化学マトリックス組成物。]
[0149] １２、Ｚが−ＮＨ−ＣＯＣＨ3である、好ましい実施形態５の化学マトリックス組成物。]
[0150] １３、分析物の濃度の分析における使用のための化学マトリックス組成物であって、グルコース脱水素酵素；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド；ニトロソアニリン、及び
式：]
[0151] ]
[0152] ［式中、
Ｒ6は、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＮＨ2、−ＮＨ（ＣＨ2）mＯＨ、−Ｏ（ＣＨ2）mＮＨ2、及び−Ｏ（ＣＨ2）mＯＨから成る群から選択され、Ｒ2及びＲ3は、同一であるか又は異なり、そして各々、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、Ｘ-は、ハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択され、並びにｎ及びｍは約１〜約６の整数である］
で表される５−アルキルフェナジン四級塩を含む、前記組成物。]
[0153] １４、Ｒ1がＣ2Ｈ5である、好ましい実施形態１３の化学マトリックス。]
[0154] １５、前記ニトロソアニリンが、式：]
[0155] ]
[0156] ［式中、
Ｒ10は、水素、ハロゲン、アルコキシ又はアルキルチオを示し、
Ｒ11はアルキル又はヒドロキシアルキル基を示し、及び
Ｒ12はヒドロキシアルキル基を示し、或いは、
Ｒ11及びＲ12は同一であるか又は異なり、そして各々、ジアルキルアミノアルキル基、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、又はアルコキシアルキル基を表し、或いは、
Ｒ11及びＲ12は、硫黄、窒素、又は置換された窒素基によって中断されるアルキレン基を形成し、或いは、
Ｒ10がＮＲ11Ｒ12に対してオルト位に位置する場合、Ｒ11はまた、Ｒ10と一緒になってアルキレン基を表し、ここでＲ12はヒドロキシアルキル基を表し、或いは、
Ｒ10及びＲ12は同一であるか又は異なり、そして各々ヒドロキシアルキル基を表す］
で表される、又はその塩である、好ましい実施形態１４の化学マトリックス。]
[0157] １６、前記ニトロソアニリンが、式：]
[0158] ]
[0159] で表される、好ましい実施形態１５の化学マトリックス。]
[0160] １７、分析物の濃度の分析における使用のための化学マトリックス組成物であって、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニトロソアニリン、及び、光化学的に安定であって、分析物の濃度の決定に有用である１−カルボキシアルキルオキシ−５−アルキルフェナジンを含む、前記組成物。]
[0161] １８、前記ニトロソアニリンが、式：]
[0162] ]
[0163] ［式中、
Ｒ10は、水素、ハロゲン、アルコキシ又はアルキルチオを示し、
Ｒ11はアルキル又はヒドロキシアルキル基を示し、及びＲ12はヒドロキシアルキル基を示し、或いは、
Ｒ11及びＲ12は同一であるか又は異なり、そして各々、ジアルキルアミノアルキル基、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、又はアルコキシアルキル基を表し、或いは、
Ｒ11及びＲ12は、硫黄、窒素、又は置換された窒素基によって中断されるアルキレン基を形成し、或いは、
Ｒ10がＮＲ11Ｒ12に対してオルト位に位置する場合、Ｒ11はまた、Ｒ10と一緒になってアルキレン基を表し、ここでＲ12はヒドロキシアルキル基を表す］
で表される、好ましい実施形態１７の化学マトリックス。]
[0164] １９、前記５−アルキル−１−カルボキシアルキルオキシフェナジンが、式：]
[0165] ]
[0166] ［式中、
Ｒ6は、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＯＨ、−Ｏ（ＣＨ2）mＮＨ2、及び−Ｏ（ＣＨ2）mＯＨから成る群から選択され、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であり、Ｒ2及びＲ3は、同一であるか又は異なり、そして各々、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、
Ｘ-は、ハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択され、並びにｎ及びｍは、約１〜約６の整数である］
で表される化合物である、好ましい実施形態１８の化学マトリックス。]
[0167] ２０、液体試料中における分析物の電気化学的分析のための方法であって、当該分析物を、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニトロソアニリン、及び光化学的に安定な１−カルボキシアルキルオキシ−５−アルキルフェナジンを含むマトリックスと反応させて、電気活性剤を提供すること、前記電気活性剤によって産生される電気化学的応答を測定すること、並びに測定された電気化学的応答に基づいて液体試料中の分析物濃度を決定することを含む、前記方法。]
[0168] ２１、前記分析物がグルコースであり、そして前記試料が約２０ｍｇ／ｄＬ〜約６００ｍｇ／ｄＬの血液グルコースを含む、好ましい実施形態２０の方法。]
[0169] ２２、前記化学マトリックスがｐＨ約６．５〜約８．５である、好ましい実施形態２０の方法。]
[0170] ２３、液体試料中における分析物の電気化学的分析のための方法であって、化学マトリックスを含むテストストリップを有するバイオセンサーの適用領域へ前記試料を適用し、前記分析物を前記化学マトリックスとの反応によって定量し、そして前記バイオセンサーを用いた使用のために構成されたモニター装置のディスプレイ上に前記定量の結果を表示することを含み、ここで前記化学マトリックスは、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニトロソアニリン、及び、式：]
[0171] ]
[0172] ［式中、
Ｚは、−（ＣＨ2）mＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＯＣＨ3、及び−ＯＹから成る群から選択され、ここでｍは０〜約６の任意の整数であり、そしてＹは：]
[0173] ]
[0174] （式中、
ｎは約１〜約４の整数であり；
Ｑは、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＯＨ、−ＮＨＣＨ2ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）o−Ｇ、−（ＣＨ2）OＮＲ2Ｒ3、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、又は−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＯＨであり；
そしてＧは、−ＣＯＯＨ、ＮＲ2Ｒ3、又は]
[0175] ]
[0176] である）
から成る群から選択され、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であり、
Ｒ2及びＲ3は、同一であるか又は異なり、そして各々Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、
ｏは約１〜約６の整数であり；
そしてＸはハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択されるアニオンである］
で表される５−アルキルフェナジン四級塩を含む、前記方法。]
[0177] ２４、前記定量が、約２０〜約６００ｍｇ／ｄＬの血液グルコースレベルを有する前記試料のために行われ得る、好ましい実施形態２３の方法。]
実施例

[0178] ２５、前記定量、及び前記表示が、前記試料を適用後約５秒以下で行われる、好ましい実施形態２３の方法。]

权利要求:

請求項1
分析物濃度の決定において有用である化学マトリックス組成物であって、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、５−アルキルフェナジン四級塩、及びニトロソアニリンを含み、ｐＨ６．５〜８．５で安定であり、そして光化学的に安定である、前記化学マトリックス組成物。
請求項2
前記５−アルキルフェナジン四級塩が、式：［式中、Ｚは、−（ＣＨ2）mＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＯＣＨ3、及び−ＯＹから成る群から選択され、ここでｍは０〜６の任意の整数であり得、そしてＹは：（式中、ｎは１〜４の整数であり、Ｑは、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＯＨ、−ＮＨＣＨ2ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）o−Ｇ、−（ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、又は−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＯＨであり、ここでＧは−ＣＯＯＨ、ＮＲ2Ｒ3、又は：である）から成る群から選択され、Ｒ1はＣ1〜Ｃ6アルキル基であり、Ｒ2及びＲ3は同一であるか又は異なり、そして各々Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、ｏは、１〜６の整数であり；並びに、Ｘは、ハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択されるアニオンである］で表される化合物である、請求項１に記載の化学マトリックス組成物。
請求項3
前記ニトロソアニリンが、式：［式中、Ｒ10は、水素、ハロゲン、アルコキシ又はアルキルチオを示し、Ｒ11はアルキル又はヒドロキシアルキル基を示し、及びＲ12はヒドロキシアルキル基を示し、或いは、Ｒ11及びＲ12は同一であるか又は異なり、そして各々、ジアルキルアミノアルキル基、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、又はアルコキシアルキル基を表し、或いは、Ｒ11及びＲ12は、硫黄、窒素、又は置換された窒素基によって中断されるアルキレン基を形成し、或いは、Ｒ10がＮＲ11Ｒ12に対してオルト位に位置する場合、Ｒ11はまた、Ｒ10と一緒になってアルキレン基を表し、ここでＲ12はヒドロキシアルキル基を表し、或いは、Ｒ10及びＲ12は同一であるか又は異なり、そして各々ヒドロキシアルキル基を表す］で表される化合物、又はその塩である、請求項１に記載の化学マトリックス組成物。
請求項4
Ｒ1がＣ2Ｈ5である、請求項２に記載の化学マトリックス組成物。
請求項5
前記ニトロソアニリンが、式：で表される、請求項４に記載の化学マトリックス組成物。
請求項6
Ｚが、−Ｏ−（ＣＨ2）3ＣＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）4ＣＯ−ＮＨＣＨ2ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）4−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）4−ＮＨ2、−Ｏ−（ＣＨ2）3−ＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ2）4−ＯＣＨ3、−（ＣＨ2）ＣＯＯＨ、及び−ＮＨ−ＣＯＣＨ3から成る群から選択される、請求項５に記載の化学マトリックス組成物。
請求項7
分析物の濃度の分析における使用のための化学マトリックス組成物であって、グルコース脱水素酵素；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド；ニトロソアニリン、及び式：［式中、Ｒ6は、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＯＨ、−Ｏ（ＣＨ2）mＮＨ2、及び−Ｏ（ＣＨ2）mＯＨから成る群から選択され、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であり、Ｒ2及びＲ3は、同一であるか又は異なり、そして各々、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、Ｘ-は、ハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択され、並びにｎ及びｍは、１〜６の整数である］で表される５−アルキルフェナジン四級塩を含む、前記化学マトリックス組成物。
請求項8
Ｒ1がＣ2Ｈ5である、請求項７に記載の化学マトリックス組成物。
請求項9
前記ニトロソアニリンが、式：［式中、Ｒ10は、水素、ハロゲン、アルコキシ又はアルキルチオを示し、Ｒ11はアルキル又はヒドロキシアルキル基を示し、及びＲ12はヒドロキシアルキル基を示し、或いは、Ｒ11及びＲ12は同一であるか又は異なり、そして各々、ジアルキルアミノアルキル基、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、又はアルコキシアルキル基を表し、或いは、Ｒ11及びＲ12は、硫黄、窒素、又は置換された窒素基によって中断されるアルキレン基を形成し、或いは、Ｒ10がＮＲ11Ｒ12に対してオルト位に位置する場合、Ｒ11はまた、Ｒ10と一緒になってアルキレン基を表し、ここでＲ12はヒドロキシアルキル基を表し、或いは、Ｒ10及びＲ12は同一であるか又は異なり、そして各々ヒドロキシアルキル基を表す］で表される化合物、又はその塩である、請求項８に記載の化学マトリックス組成物。
請求項10
前記ニトロソアニリンが、式：で表される、請求項９に記載の化学マトリックス組成物。
請求項11
分析物の濃度の分析における使用のための化学マトリックス組成物であって、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニトロソアニリン、及び、光化学的に安定であって、分析物の濃度の決定に有用である１−カルボキシアルキルオキシ−５−アルキルフェナジンを含む、前記化学マトリックス組成物。
請求項12
前記ニトロソアニリンが、式：［式中、Ｒ10は、水素、ハロゲン、アルコキシ又はアルキルチオを示し、Ｒ11はアルキル又はヒドロキシアルキル基を示し、及びＲ12はヒドロキシアルキル基を示し、或いは、Ｒ11及びＲ12は同一であるか又は異なり、そして各々、ジアルキルアミノアルキル基、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、又はアルコキシアルキル基を表し、或いは、Ｒ11及びＲ12は、硫黄、窒素、又は置換された窒素基によって中断されるアルキレン基を形成し、或いは、Ｒ10がＮＲ11Ｒ12に対してオルト位に位置する場合、Ｒ11はまた、Ｒ10と一緒になってアルキレン基を表し、ここでＲ12はヒドロキシアルキル基を表す］で表される、請求項１１に記載の化学マトリックス組成物。
請求項13
前記５−アルキル−１−カルボキシアルキルオキシフェナジンが、式：［式中、Ｒ6は、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）mＯＨ、−Ｏ（ＣＨ2）mＮＨ2、及び−Ｏ（ＣＨ2）mＯＨから成る群から選択され、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であり、Ｒ2及びＲ3は、同一であるか又は異なり、そして各々、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、Ｘ-は、ハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択され、並びにｎ及びｍは、１〜６の整数である］で表される化合物である、請求項１２に記載の化学マトリックス組成物。
請求項14
液体試料中における分析物の電気化学的分析のための方法であって、当該分析物を、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニトロソアニリン、及び光化学的に安定な１−カルボキシアルキルオキシ−５−アルキルフェナジンを含むマトリックスと反応させて、電気活性剤を提供すること、前記電気活性剤によって産生される電気化学的応答を測定すること、並びに測定された電気化学的応答に基づいて液体試料中の分析物濃度を決定することを含む、前記方法。
請求項15
液体試料中における分析物の電気化学的分析のための方法であって、化学マトリックスを含むテストストリップを有するバイオセンサーの適用領域へ前記試料を適用し、前記分析物を前記化学マトリックスとの反応によって定量し、そして前記バイオセンサーを用いた使用のために構成されたモニター装置のディスプレイ上に前記定量の結果を表示することを含み、ここで前記化学マトリックスは、グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニトロソアニリン、及び、式：［式中、Ｚは、−（ＣＨ2）mＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＯＣＨ3、及び−ＯＹから成る群から選択され、ここでｍは０〜６の整数であり、並びにＹは：（式中、ｎは１〜４の整数であり；Ｑは、−ＯＨ、−ＯＲ1、−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、−ＮＨ（ＣＨ2）oＯＨ、−ＮＨＣＨ2ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）o−Ｇ、−（ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＮＲ2Ｒ3、又は−（ＯＣＨ2ＣＨ2）oＯＨであり；並びにＧは、−ＣＯＯＨ、ＮＲ2Ｒ3、又は：である）から成る群から選択され、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であり、Ｒ2及びＲ3は、同一であるか又は異なり、そして各々Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表し、ｏは１〜６の整数であり；並びにＸは、ハライド、サルフェート、アルキルサルフェート、ホスフェート、ホスファイト、カルボキシレート、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＯＳＯ2-、Ｃ2Ｈ5ＯＳＯ2-、及びＣＨ3ＳＯ3-から成る群から選択されるアニオンである］で表される５−アルキルフェナジン四級塩を含む、前記方法。